Ядерный импорт

Импорт в ядро ​​и активация NF-κB достигается за счет цитокин-зависимого фосфорилирования и последующей деградации ингибирующего белка IκB. Интересно, что было показано, что IL-1 стимулирует гепсидин в первичных гепатоцитах как у мышей дикого типа, так и у мышей с нокаутом IL-6 (Lee, Peng, Gelbart, Wang, and Beutler, 2005), что позволяет предположить, что IL-1 может играть роль IL-6. — независимая роль в активации гепсидина при воспалении.

Связанные термины:

• Цитоплазма
• белок
• ДНК
• Сигнал ядерной локализации
• Фосфотрансфераза
• нуклеофосмин
• фосфорилирование
• Вирус иммунодефицита человека
• Ядерный экспорт

Скачать

Скачать в формате PDF

Белл
Информация

Об этой странице

ЭПИТЕЛИЙ | КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

Авраам Л. Кирзенбаум, доктор медицины, доктор философии. , в гистологии и клеточной биологии: введение в патологию, 2020 г.

Импорт и экспорт белковых ядер (Primer 1-H)

Ядерный транспорт белков в ядро ​​и из ядра происходит через комплексы ядерных пор и включает пространственный и временной цикл взаимодействий между грузами, переносчиками иРан (заРаs-подобныйнясно).

Мы уже указывали, что белки-карго помечены короткими метками для импорта в ядро. сигнал ядерной локализации (NLS) последовательности (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val). Через ядерно-поровый комплекс транспортируется около 100–1000 грузов в минуту.

Молекулы-носители вместе называются βкариоферины, с назначенными импортными перевозчикамиимпортины (такие какимпортин β иимпортин α) и экспортные перевозчики, называемыеэкспортины.

Импорт/экспорт белковых ядер контролируетсяРан, малая ГТФаза суперсемейства Ras, определяющая направленность ядерно-цитоплазматического транспорта.

Как работает механизм ядерного импорта/экспорта?

Образуется импортный комплекс, состоящий из белка с NLS, импортина α и импортина β.в цитоплазме.

Циклы между цитоплазмой-ядром-цитоплазмой:РанВВП челноки через комплексы ядерных пор с помощью активного транспортного механизма, включающегоядерный транспортный фактор 2 (NTF2) и накапливается внутри ядра.

В ядре,Рангуаниновый фактор обмена нуклеотидов (RanGEF) катализирует обмен нуклеотидов и генерирует RanGTP из импортированного RanGDP.

В ядре, Ran GDP переходит в состояние, связанное с GTP, катализируемоеФактор обмена ран-гуаниновых нуклеотидов (RanGEF).

Также в ядре импортированные белки, содержащие NLS, транспортируемые импортинами а и импортином β, диссоциируют в присутствии RanGTP.

Импортин α экспортируется в комплексе со своим ядерным экспортным фактором,КАС (αβкариоферин)и РанГТП.

Импортинβ в комплексе с RanGTP рециркулирует в цитоплазму.

В цитоплазме, RanGTP преобразуется в RanGDP путемРанГАП (заRan-GTPase-активирующий белок). RanGDP отделяется от импортинов, которые становятся свободными для другого цикла ядерного импорта.

Обратите внимание, что RanGTPэкспортируется из ядра, связанного с носителем β-кариоферина CAS. РанВВПимпортированный в ядро ​​своим специфическим переносчиком NTF2.

Генетические манипуляции посредством переноса генов

6.2.2.3 Ядерный импорт и судьба генетической полезной нагрузки

Ядерный импорт экзогенной ДНК эффективно происходит в делящихся клетках, поскольку ядерная оболочка разбирается во время М-фазы клеточного деления [9]. Митотически активные клетки включают многие, но не все, тканевые мишени, относящиеся к этому объему. Для неделящихся клеток проникновение в ядро ​​является более сложным, поскольку молекулы ДНК, используемые в приложениях генной терапии, слишком велики, чтобы пройти через комплекс ядерных пор, и должны проникать в ядро ​​посредством облегченного транспорта. Характеристика так называемых ядерных белков-челноков, которые связывают экзогенную ДНК и впоследствии взаимодействуют с механизмами ядерного транспорта, была активной областью исследований [10, 11].К счастью, практический результат этой сложной темы заключается в том, что вирусные векторы, содержащие обычно используемые энхансерные последовательности, такие как SV40, достаточны для управления ядерным импортом и надежной экспрессией в неделящихся клетках.

В зависимости от используемой векторной системы генетические полезные нагрузки принимают одну из двух совершенно разных ядерных судеб: эписомную персистенцию или хромосомную интеграцию. Эписомная персистенция является ключевой детерминантой продолжительности экспрессии трансгена, но она плохо изучена и может вовлекать субкомпартменты ядра, по крайней мере, в случае AAV [6]. Такие векторы, как лентивирусы, ВПГ и другие, полагаются на естественную физиологию родительского вируса для интеграции генетической полезной нагрузки в хромосомы клетки-хозяина. Эта интеграция выглядит случайной или, по крайней мере, непредсказуемой и представляет риск «генотоксичности» — явления, при котором интеграция генетической полезной нагрузки происходит проксимальнее онкогена. Генотоксичность широко наблюдалась и изучалась в доклинических моделях и была окончательно связана с онкогенезом у пациентов, получавших генную терапию [12–14]. Интересно, что генотоксический риск, связанный с интеграцией кассеты терапевтической экспрессии, не соответствует ожидаемому увеличению продолжительности экспрессии, поскольку встроенные трансгены замалчиваются примерно в те же сроки, что и трансгены, сохраняющиеся в виде эписом. В совокупности эти проблемы безопасности объясняют относительное предпочтение неинтегрирующихся векторов аденовируса и AAV в стоматологических и черепно-лицевых применениях переноса генов.

URL-адрес: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123971579000084.

Механизмы, управляющие активностью сигнальных последовательностей локализации

Массимо Д’Агостино, Стефано Бонатти, справочный модуль по наукам о жизни, 2017 г.

Зависимое от фосфорилирования ингибирование распознавания сигналов локализации

Механизм ядерного импорта многих белков, связанных с клеточным циклом, контролируется событиями фосфорилирования внутри или вблизи их NLS, что предотвращает связывание с белком-транспортером и, таким образом, подавляет ядерный импорт. Например, сахаромицеты церевисиае Факторы транскрипции Swi5 фосфорилируются во время клеточного цикла (конец G1) циклинзависимой киназой Cdc28 (гомолог CDK1 млекопитающих) по остаткам серина в его NLS (636-KKYENVVIKRSPRKRGRPRKDGTSSVSSS-674), что снижает его ядерный импорт за счет подавления связывания с его транспортер ( Молл и другие., 1991; Сбия и другие., 2008; Табернер и другие., 2012). Однако фосфатаза клеточного цикла Cdc14 реверсирует это фосфорилирование во время митоза, восстанавливая ядерный импорт (Visintin и другие., 1998; Рис. 1(А)). Напротив, о событиях фосфорилирования внутри или вблизи NES часто не сообщалось. Однако хорошим примером является супрессор критической опухоли p53 (Kracikova и другие., 2013 ). Вследствие ионизирующего излучения, ультрафиолетового излучения, оксида азота и активных форм кислорода (Лику и другие., 2005), активируются несколько киназ реакции на повреждение ДНК: мутированная атаксия телеангиэктазии (ATM), атаксия телеангиэктазии и связанная с Rad3 (ATR), протеинкиназа ДНК-зависимый каталитический полипептид (PRKDC) и циклинзависимая киназа 5 (CDK5) ( Кадоваки и другие., 2015). Эти киназы фосфорилируют остатки серина и треонина в мотиве р53 NES (14-LSQETLSDLWKL-25), предотвращая связывание экспортина 1 с NES и подавляя ядерный экспорт р53 (Martinez и другие., 1997; Банин и другие., 1998; Канман и другие., 1998; Тиббеттс и другие., 1999; Чжан и Сюн, 2001 г.; Шнайдерхан и другие., 2003; Рис. 1(Б)).

URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128096338120175

ВВЕДЕНИЕ

C. Важность шаттла VDR/RXR для транскрипционной активности.

В естественных условиях Важность ядерного импорта и экспорта для действия кальцитриола была продемонстрирована в экспериментах на фибробластах пациентов с наследственной резистентностью к кальцитриолу [15]. Как и ожидалось, мутации в NLS VDR и RXR ингибировали транскрипционную активность, индуцированную кальцитриолом. Репортерные анализы люциферазы (фиг. 10) показали, что коэкспрессия nls1GFP-VDR с nls1RXR-BFP полностью блокирует транскрипционную активность, и даже nls1GFP-VDR, экспрессируемый отдельно, имел минимальную транскрипционную активность. Деятельность nls1GFP-VDR значительно увеличивался за счет коэкспрессии RXR дикого типа. Коэкспрессия nls1RXR-BFP с GFP-VDR дикого типа снижал индуцированную кальцитриолом транскрипцию 24Ohase/Luc. Эти результаты показали тесную корреляцию между активностью транскрипции и локализацией в ядре, указывая на физиологическую значимость компартментализации рецепторов [20].

Неожиданно ингибирование ядерного экспорта также блокирует транскрипционную активность (Fig. 9C). Обработка клеток, экспрессирующих GFP-VDR, с помощью LMB вызывала задержку рецепторов в ядре и предотвращала влияние кальцитриола на экспрессию репортерного гена. LMB был неэффективен для изменения экспорта рецепторов и транскрипционной активности, когда его добавляли после кальцитриола [20]. На основании этих результатов мы впервые предположили, что экспорт рецептора способствует транскрипционной активности VDR. Впоследствии важность ядерного экспорта для передачи сигналов была продемонстрирована для др. белков, таких как Smad 1 [70].

URL-адрес: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780122526879500255.

Движение вирусов внутри растений

Несмотря на большое сходство с другими эукариотическими системами, импорт ядер у растений может обладать рядом уникальных особенностей. У разных видов растений могли развиться разные механизмы импорта ядер.В то время как ядерный импорт белков, содержащих NLS основного типа, у риса (и, возможно, у других однодольных растений) опосредуется гетеродимером импортина α/β, в А. талиана (и, скорее всего, у других двудольных), импорт в ядро ​​стимулируется только импортином α, без потребности в импортине β. Действительно, арабидопсис геном не кодирует истинный гомолог импортина β, который функционирует в зависимом от импортина α пути импорта, как у дрожжей и животных. Таким образом, хотя арабидопсис Импортин α [AtIMPα или AtKAPα] гомологичен по своей последовательности импортину α других, нерастительных эукариот, вероятно, отличается от них функционально. Кроме того, ядерный импорт происходит при 4°C у растений, тогда как у животных он ингибируется при низких температурах.

URL-адрес: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123848710000108.

Комплексы ядерных пор и ядерно-цитоплазматический транспорт — методы

Тияна Йованович-Талисман. Майкл П. Раут, Методы клеточной биологии, 2014 г.

17.1.2 Очистка и флуоресцентное мечение транспортных факторов, грузовых белков и контрольных белков

Транспортные факторы распознают субстраты грузов и опосредуют ядерный импорт и/или экспорт. Человеческий ядерный транспортный фактор 2 (NTF2) (Moore and Blobel, 1994) представляет собой димерный белок, который облегчает ядерный импорт GTPase Ran, обеспечивая эффективную регуляцию транспорта белка через NPC. Для наших исследований мы помечаем NTF2 глутатионом. С-трансферазы (GST) или желтого флуоресцентного белка (YFP) для обеспечения размера выше предела пассивной диффузии. Приведен краткий протокол получения чистых белков:

NTF2–GST человека в pGEX-2T и NTF2–YFP-His₆ в pET21b трансформируются в клетки BL21DE3.

Клетки выращивают в среде LB с добавлением антибиотиков, индуцируют 0,1 мМ IPTG при OD.₆₀₀ ~ 0,8 и инкубировали ~ 12 ч при 30 °С (NTF2–GST) и 23 °С (NTF2–YFP).

Клетки собирают, лизируют и очищают белок из осветленного лизата с использованием смолы глутатион-сефарозы (NTF2-GST) или колонок HisTrapFF и Superose 6 (NTF2-YFP).

Чтобы исследовать механизм ядерно-цитоплазматического транспорта с использованием наноселективного фильтра, мы также очистили кариоферины Kap95 (с использованием плазмиды Kap95-GST в векторе pGEX-2T-K) и Kap121 (с использованием плазмиды Kap121-GST в векторе pGEX-4T-1), как описано ранее ( Йованович-Талисман и др., 2009; Лесли и др., 2004). Метка GST удаляется с помощью набора для захвата расщепления тромбина (Novagen) в соответствии с инструкциями производителя. Грузовой белок: сайт связывания импортина-β импортина альфа (Ibb), помеченный GFP, и контрольный белок: GFP получают с использованием Ibb-eGFP-His.₆ и eGFP-His₆ плазмиды в векторе pET21b соответственно. Ibb-GFP образует комплекс с Kap95, тогда как GFP этого не делает.

Чистые контрольные белки (БСА, IgG, РНКаза А, бычий апотрансферрин) можно приобрести у различных поставщиков.

Примечания

Важно получить правильное состояние олигомеризации транспортных факторов (например, димерный NTF2, мономерный Kaps); таким образом, этап эксклюзионной хроматографии в процессе очистки важен. Образование комплексов (например, между транспортным фактором и грузом) всегда подтверждается эксклюзионной хроматографией.

Либо флуоресцентные белки, либо флуоресцентные красители могут быть использованы в качестве репортеров для измерений с помощью конфокальной микроскопии. Флуоресцентные белки менее яркие, метка может быть громоздкой или даже мешать функции белка при неправильной инженерии; однако достигается стехиометрическое и сайт-специфическое мечение, и белки не склонны к агрегации. В качестве альтернативы можно использовать различные яркие флуоресцентные коммерчески доступные красители (см. ниже). Белки маркируются в соответствии с рекомендациями производителя с целью достижения маркировки, близкой к стехиометрической. Эксклюзионная хроматография используется для удаления свободных красителей и агрегированных меченых белков.Кроме того, этап ультрацентрифугирования (112 000 × грамм_{средний} в течение 45 мин в роторе TLA55 (Beckman) при 4 °С) можно использовать для удаления микроагрегатов перед каждым экспериментом. Эксклюзионная хроматография и нативные гели используются для подтверждения надлежащего состояния олигомеризации меченых белков. Флуоресцентные белки в нативных гелях выявляют с помощью устройства для визуализации Variable Imager Typhoon 9400.

Примечания

Мы обнаружили, что для многих транспортных факторов мечение сульфгидрильных групп предпочтительнее первичных аминов, поскольку мечение цистеином обычно приводит к меньшей агрегации.