Комплекс ядерных пор и белок DEAD Box Rat8p/Dbp5p обладают несущественными свойствами, которые, по-видимому, облегчают экспорт мРНК после теплового шока.
* Соответствующий автор. Почтовый адрес: кафедра биохимии Дартмутской медицинской школы, 7200 Vail Building, Hanover, NH 03755. Телефон: (603) 650-1628. Факс: (603) 650-1128. Электронная почта: ude.htuomtraD@eloc.selrahc.
Поступило 9 декабря 2003 г .; Пересмотрено 2 февраля 2004 г .; Принято 15 марта 2004 г.
Авторские права © 2004, Американское общество микробиологии.
Абстрактный
Комплексы ядерных пор (NPC) играют важную роль в экспорте РНК. Нуклеопорины, необходимые для экспорта мРНК в сахаромицеты церевисиае обнаружены в субкомплексах Nup84p и Nup82p NPC. Субкомплекс Nup82p содержит Nup82p, Rat7p/Nup159p, Nsp1p, Gle1p/Rss1p и Rip1p/Nup42p и обнаруживается только на цитоплазматической стороне NPC. Как Rat7p, так и Gle1p содержат сайты связывания Rat8p/Dbp5p, важного белка DEAD box и предполагаемой РНК-хеликазы. Rip1p взаимодействует непосредственно с Gle1p и является единственным известным белком, необходимым для экспорта мРНК после теплового шока, но не в нормальных условиях роста. Мы сообщаем, что в клетках, лишенных Rip1p, как Gle1p, так и Rat8p диссоциируют от NPC после теплового шока при 42°C. Rat8p, но не Gle1p, сохранялся у NPC, если rip1Δ-клетки были сначала сдвинуты до 37°C, а затем до 42°C, и это коррелировало с сохранением экспорта мРНК при тепловом шоке. rip1Δ клетки. Экспорт после этанольного шока в меньшей степени зависел от присутствия Rip1p. Воздействие 10% этанола приводило к диссоциации Rat8p от NPC как у дикого типа, так и у rip1Δ клетки. После такой обработки Rat8p был преимущественно ядерным в клетках дикого типа, но преимущественно цитоплазматическим в клетках дикого типа. rip1Δ клетки. Мы также определили, что эффективный экспорт мРНК теплового шока после теплового шока зависит от нового 6-аминокислотного элемента в Rat8p. Этот мотив не требуется при нормальных условиях роста или после этанольного шока. Эти исследования предполагают, что молекулярный механизм, ответственный за дефект экспорта мРНК теплового шока у rip1Клетки Δ представляют собой диссоциацию Rat8p от NPC. Эти исследования также предполагают, что и ядерные поры, и Rat8p обладают особенностями, не необходимыми для экспорта мРНК в растущие клетки, но которые усиливают способность мРНК к экспорту после теплового шока.
Экспорт мРНК из мест их синтеза в ядре в места трансляции в цитоплазме является сложным процессом и требует нескольких классов белков (20, 44). Множественные мРНК-связывающие белки связаны с мРНК, образуя комплекс мРНК-рибонуклеопротеин, мРНП (8). Эти ассоциации начинаются во время ранней транскрипции и требуют специфических взаимодействий между белками mRNP и механизмом транскрипции (19; рассмотрено в ссылке 17). Считается, что зависимость экспорта мРНК от этих белков отражает их роль в упаковке мРНК в экспортируемую конфигурацию. Экспорт также требует, чтобы процессинг пре-мРНК был завершен, и это может оставить какой-то белковый сигнал или конфигурацию на мРНП, указывающие на то, что она созрела и готова к экспорту (обзор в ссылках 4, 15 и 25).
Экспорт также зависит от комплекса ядерных пор (NPC), очень большого макромолекулярного комплекса (60 МДа у дрожжей и около 120 МДа у высших организмов), собранного с использованием множества копий примерно 30–35 белков, называемых нуклеопоринами (28, 36). Нуклеопорины играют как структурную, так и функциональную роль. Некоторые из них содержат предполагаемые спиральные домены, которые считаются важными для поддержания общей структуры пор.Около четверти содержат домен с множественными повторами последовательности, богатой фенилаланином и глицином, называемые повторами FG, которые, как полагают, служат сайтами стыковки для специфических транспортных факторов (20, 25, 27, 40).
Нуклеопорины, необходимые для экспорта мРНК, обнаружены в двух субкомплексах NPC. Первый, субкомплекс Nup84p, содержит Nup84p, Nup85p, Nup120p, Sec13p, Seh1p, Nup145p-C и Nup133p (34). Субкомплекс Nup82p содержит Rat7p/Nup159p, Nup82p, Nsp1p, Rss1p/Gle1p и Rip1p/Nup42p и был в центре внимания предыдущих исследований нашей группы (1, 2, 6, 9, 12, 13). Эти два субкомплекса, по-видимому, находятся в непосредственной близости, поскольку между Gle1p и Nup145p-C происходит резонансный перенос энергии флуоресценции (5). Большинство нуклеопоринов присутствуют как в ядерной, так и в цитоплазматической частях NPC. Rat7p, Gle1p, Nup82p и Rip1p являются единственными нуклеопоринами, обнаруженными исключительно на цитоплазматической стороне (28). Филаменты, которые простираются в цитоплазму, состоят из некоторых белков субкомплексов Nup82p и Nup84p (36, 40). Помимо спиральных доменов, которые опосредуют взаимодействия между компонентами субкомплекса Nup82p, два из этих белков (Rat7p и Rip1p) содержат множественные повторы FG. На жизнеспособность клеток не влияет делеция повторов как из Rat7p, так и из Rip1p (6, 38, 39).
Клетки содержат много белков DEAD-бокса (в клетках более 30 белков DEAD-бокса и DEXD/H-бокса). сахаромицеты церевисиае), и они участвуют практически во всех аспектах метаболизма мРНК (rev. reference 41). Хотя биохимические свойства большинства белков DEAD box не были исследованы, все те, которые были изучены биохимически, связываются с АТФ и гидролизуют его. Было показано, что некоторые из них способны раскручивать короткие участки двухцепочечной РНК, а один способен удалять из РНК стабильно связанный белок (14, 43).
Rat8p/Dbp5p представляет собой белок DEAD box и важный фактор экспорта мРНК, который перемещается между цитоплазмой и ядром (11).В клетках, несущих термочувствительные (ts) аллели RAT8, поли(А) + мРНК быстро накапливается в ядрах всех клеток после сдвига до 37°С (35, 42). Субкомплекс Nup82p NPC предоставляет сайты стыковки для Rat8p, который связывается с последовательностями в пределах N-концевой трети Rat7p и С-концевой области Gle1p (11, 33, 37). Быстро возникающие дефекты экспорта мРНК также возникают при изменении температуры до 37°C в клетках, несущих тс мутантные аллели крыса7 а также gle1/rss1 (6, 7, 11). Сверхэкспрессия Rat8p подавляет дефекты роста крыса7—1, крыса7ΔN и rss1—37 клетки (11). В крыса7—1 а также rss1—37 клеток наблюдается умеренное снижение блока экспорта мРНК, и клетки способны медленно расти при непермиссивной температуре. Напротив, сверхэкспрессия Rat8p полностью подавляет как экспорт мРНК, так и дефекты роста. крыса7ΔN клеток (11). Белки, которые связаны с мРНК в ядре, удаляются из мРНК на поздней стадии экспорта мРНК, что позволяет им вернуться в ядро для дополнительных раундов экспорта мРНК. Связываясь с субкомплексом Nup82p на цитоплазматической поверхности NPC, Rat8p может располагаться для удаления белков mRNP из мРНК во время экспорта.
После теплового или этанольного шока полиаденилированные мРНК накапливаются в ядре, но быстро индуцируется транскрипция генов, кодирующих белки теплового шока, и мРНК теплового шока эффективно экспортируются (23, 24, 31). Экспорт мРНК теплового шока зависит почти от всех белков, необходимых для экспорта мРНК в нестрессовых условиях. Один белок mRNP, необходимый для нормального экспорта мРНК, Npl3p, не требуется для экспорта теплового шока (18, 32). Наоборот, экспорт мРНК после теплового шока зависит от одного белка, незаменимого для экспорта в нестрессовых условиях, нуклеопорина Rip1p/Nup42p, компонента субкомплекса Nup82p.Штамм, лишенный Rip1p, растет так же, как и дикий тип, при всех температурах до 37°C и не имеет выявляемых дефектов в ядерно-цитоплазматическом транспорте ни при каких условиях роста (32, 37, 39). Ранее мы сообщали, что сильный дефект в экспорте всей мРНК возникает после теплового шока у rip1Δ-клетки (32).
Исследования, о которых здесь сообщается, были направлены на понимание молекулярной основы, лежащей в основе потребности в Rip1p для экспорта мРНК после теплового шока. Мы сообщаем, что в отсутствие Rip1p и Gle1p, и Rat8p теряются из NPC после перехода к 42°C. Кроме того, мы идентифицировали область Rat8p, необходимую для экспорта во время теплового шока, но не в нормальных условиях роста. Эта область отсутствует во всех других белках DEAD-бокса дрожжей, но встречается во всех известных ортологах Rat8p. Мы также сравнили экспорт мРНК у дикого типа и rip1Δ-клетки после этанолового стресса. Мы наблюдали умеренный дефект в экспорте мРНК теплового шока у rip1Δ-клетки после шока 5% этанолом. Интересно, что ни дикий тип, ни rip1Δ-клетки экспортировали мРНК теплового шока после шока 10% этанолом, и в обоих случаях Rat8p терялся из NPC. Исследования, о которых здесь сообщается, подчеркивают критическую роль Rat8p для экспорта мРНК при любых условиях и демонстрируют, что его ассоциация с NPC после теплового шока требует наличия Rip1p.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы, плазмиды и условия роста.
Штаммы дрожжей, перечисленные в таблице 1, выращивали при 23°C в среде, богатой дрожжевым экстрактом, пептоном и декстрозой, или в синтетической полной среде без лейцина, урацила или того и другого. Трансформацию дрожжей проводили стандартным методом с ацетатом лития (21).
