Загрязнение клеточной культуры – часть 3

В третьей статье нашей серии из трех статей об инкубации с CO2 обсуждается, как предотвратить заражение клеточных культур бактериями (включая микоплазмы), вирусами и грибками или даже перекрестное заражение другими клеточными линиями.

12 июля 2011 г. | 5+ минут чтения Мэри Кэй Бейтс, Дуглас Вернершпах
PDF-версия

Это третья часть нашей серии из трех статей о CO.₂ инкубация.

Загрязнение клеточных культур бактериями (включая микоплазмы), вирусами и грибками или даже перекрестное заражение другими клеточными линиями может привести к значительной потере ресурсов любой исследовательской или фармацевтической лаборатории. Наиболее эффективным способом снижения риска биологических контаминантов является правильное использование асептических методов при работе с клетками и реагентами. Основные передовые лабораторные методы также важны и включают эффективную стерилизацию оборудования, сред и реагентов; использование выделенных сред для каждого типа ячеек; ношение перчаток и лабораторных халатов; и держать лабораторию свободной от пыли и беспорядка. Совместно₂ Инкубатор, используемый для обеспечения идеальной среды для размножения клеточных культур, также обеспечивает прекрасную среду для роста микробов, поэтому его следует считать особо заслуживающим внимания. Существуют различные методологии для предотвращения и устранения загрязнения CO.₂ инкубаторы. Лучшие варианты для вашей лаборатории зависят от количества и типов клеток, которые вы выращиваете, количества персонала в вашей лаборатории и того, насколько плюсы и минусы метода соответствуют вашему рабочему процессу.

Методы предотвращения загрязнения

Практически невозможно предотвратить попадание микробов в CO.₂ инкубаторе каждый раз, когда мы открываем дверь, если только сама лаборатория не является чистым помещением. Микроорганизмы, в первую очередь бактерии, являются нашими постоянными спутниками. Они циркулируют в воздухе и покрывают каждую часть нашего тела. На самом деле, недавний отбор проб с помощью мазков с кожи человека выявил 10 000 микроорганизмов/см2.1 Мы не можем не выделять бактерии с кожи, волос и дыхания, и они попадают в сосуды для культивирования и в камеру инкубатора.

Поэтому в последние годы производители инкубаторов для культивирования клеток представили ряд различных опций, помогающих предотвратить рост нежелательных микроорганизмов внутри инкубатора — даже после того, как они туда попали. Понимание доступных методологий гарантирует, что вы выберете технологию, которая наилучшим образом соответствует требованиям вашей лаборатории и рабочей среде.

Сенсорные поверхности из чистой меди

Один из подходов к предотвращению микробного роста в инкубаторе, не требующий ручного труда или технического обслуживания, имеет тысячелетнюю историю: чистая твердая медь. Древние общества успешно использовали медь для местного лечения кожных заболеваний и ран. Сегодня медь пользуется популярностью в клинических науках, а в 2008 году Агентство по охране окружающей среды США сертифицировало, что чистая медь «убивает 99,9% бактерий в течение двух часов»2. Доказано, что медь даже эффективна против бактериальных спор. 3

Признавая эффективную противомикробную активность меди, инкубаторы со 100-процентно чистыми внутренними камерами из твердой меди завоевали большую популярность в сообществе исследователей клеточных культур. Использование меди в CO₂ инкубаторах имеет еще больше смысла с учетом того, что более высокая температура и более высокая относительная влажность повышают антимикробную эффективность меди. 4 Отражая повышенный интерес к меди, все больше производителей теперь предлагают варианты медного покрытия, включая медное покрытие и нержавеющую сталь, легированную небольшим количеством меди. Однако покрытие имеет тенденцию царапаться и отслаиваться, оставляя после себя незащищенные поверхности, и ясно, что сплавы должны содержать очень высокую долю меди — более 60 процентов — чтобы быть эффективными. 5,6

По какому механизму убивает медь? Подробности пока не ясны; однако мы знаем, что ионы меди разрушают и повреждают мембрану микробной клетки и либо проникают в клетку, либо вызывают утечку содержимого цитоплазмы. Активные формы кислорода вызывают дальнейшее повреждение, и ДНК разрушается. 4 Означает ли это, что медные поверхности представляют опасность для культивируемых клеток, растущих в СО?₂ инкубатор? Нет! Ионы меди не переносятся по воздуху, поэтому не представляют опасности для культивируемых клеток. Медь убивает только при контакте.

Камеры инкубаторов из цельной меди не требуют обслуживания, кроме периодической очистки, как и камеры из нержавеющей стали. Со временем медь тускнеет из-за окисления, и это хорошо. Потускнение фактически улучшает антимикробную эффективность. Фактически, в тестах на E. coli 99-процентная потускневшая медь убила более 100 000 бактерий за 60 минут. Затем потускнение было удалено, и медь снова испытана. В этом 60-минутном тесте с чистой 99-процентной медью было уничтожено менее 50 бактерий. 5 Сплавы, которые не тускнеют, обладают очень низкой антимикробной эффективностью, если таковая вообще отсутствует.

НЕРА-фильтр

Высокоэффективные воздушные фильтры для твердых частиц (HEPA) обычно используются во многих областях, включая здравоохранение и безопасность. Они улавливают переносимые по воздуху загрязнители, включая пыль, аллергены и микроорганизмы, а некоторые могут улавливать летучие органические химические вещества.

HEPA-фильтр состоит из беспорядочно расположенных боросиликатных волокон. Фильтр улавливает загрязняющие вещества с помощью трех различных механизмов: улавливание и столкновение (улавливание частиц размером более 0,4 мкм) и диффузия (улавливание мельчайших частиц, особенно тех, которые меньше 0,1 мкм). Крошечные частицы сталкиваются с молекулами воздуха в броуновском движении. Столкновения замедляют скорость частиц, и они застревают в фильтре. 7 Таким образом, труднее всего улавливать частицы размером от 0,1 до 0,4 мкм.Вот почему фильтры HEPA оцениваются в соответствии с наиболее проникающими частицами размером 0,3 мкм, которые они удаляют с эффективностью не менее 99,97%. 8 Частицы крупнее и мельче 0,3 мкм улавливаются еще эффективнее.

Фильтрация HEPA, хорошо известная по использованию в боксах биологической безопасности, идеально подходит для использования внутри CO.₂ инкубаторе для защиты культивируемых клеток от переносимых по воздуху загрязняющих веществ, которые попадают через дверцу инкубатора. Фильтры HEPA, как правило, недороги, их легко заменить, и они служат от шести месяцев до одного года. Некоторые инкубаторы оснащены удобным сигналом, напоминающим о замене фильтра. Загрязненный фильтр перед утилизацией можно просто автоклавировать вместе с другими лабораторными отходами. При оценке инкубаторов с опцией HEPA убедитесь, что фильтр HEPA соответствует требованиям по улавливанию 99,99% частиц. Чем быстрее фильтр проходит через весь объем воздуха в камере и восстанавливает условия после открытия двери, тем выше его защитная ценность.

Методы устранения загрязнения

Периодически инкубатор для клеточных культур следует очищать и обеззараживать, чтобы полностью уничтожить всю микробную жизнь. Это требует удаления всех культур и обычно делается от одного раза в неделю до двух месяцев. Немного CO₂ инкубаторы предлагают автоматизированные методы для выполнения этой задачи. Большим преимуществом этих автоматизированных систем является то, что они упрощают очистку устройства, устраняя необходимость отдельной автоклавной обработки съемных частей или использования бактерицидных чистящих средств.

Высокотемпературная дезактивация

Многие инкубаторы с прямым нагревом в настоящее время предлагают цикл обеззараживания при высокой температуре, который выполняется в течение ночи. Эти процессы направлены на устранение необходимости снятия, отдельного автоклавирования и повторной сборки полок и других компонентов инкубатора.

Однако важно спросить, что именно требуется для подготовки к предлагаемому циклу обеззараживания. Не все инкубаторы используют CO₂, датчики влажности и кислорода, совместимые с этими высокими температурами, поэтому эти датчики должны быть удалены до процедуры и заменены после нее, что требует времени, а также создает риск повторного заражения.

Сравнение подходов различных производителей может привести к путанице, поскольку диапазон температур варьируется от влажного тепла при 90°C до сухого тепла при 180°C, а руководящие принципы ISO по стерилизации пустой камеры отсутствуют. Таким образом, лучший способ оценить различные инкубаторы — это найти данные, полученные независимыми испытательными лабораториями, которые показывают уничтожение тестовых организмов.

УФ-свет

Ультрафиолетовое (УФ) излучение — это хорошо известная процедура дезинфекции боксов биобезопасности, используемых в лабораториях клеточных культур. УФ-свет иногда предлагается в качестве механизма обеззараживания некоторых CO.₂ инкубаторы. Однако CDC США, NIH и NSF больше не рекомендуют УФ в качестве единственного метода дезинфекции. 8 На это есть несколько причин. Общепризнано, что чистота, температура и размер лампы влияют на выход УФ-света, поэтому конкретная лампа может не обеспечивать заявленного уровня бактерицидной активности. Особенно это касается СО.₂ инкубаторы, работающие при высоких уровнях влажности, потому что бактерицидное действие УФ-излучения резко снижается при относительной влажности выше 70 процентов. 9 Кроме того, количество бактерицидного света, излучаемого любой УФ-лампой, уменьшается с возрастом лампы, поэтому трудно определить, действительно ли она эффективна. 8

В одной статье показано 24-часовое обеззараживание ультрафиолетом в пустом инкубаторе, которое так же эффективно, как обеззараживание при высокой температуре, для уничтожения бактерий и грибков; однако, согласно инструкциям производителя, за УФ-циклом должна сразу же следовать полная очистка камеры 70-процентным изопропиловым спиртом,10 что само по себе устранит эти микроорганизмы.Таким образом, трудно определить, произошло ли уничтожение микробной жизни из-за УФ-излучения или из-за дезинфекции спиртом. Еще одна проблема с использованием УФ-излучения заключается в том, что все, что блокирует свет (включая частицы пыли, полки и воздуховоды), препятствует эффективной дезинфекции. Это означает, что для обеззараживания углекислого газа УФ-светом₂ инкубаторе все внутренние компоненты должны быть удалены и автоклавированы отдельно для обеззараживания. 10

Токсичные химикаты

Антимикробные составы различных типов могут быть использованы для очистки салона от СО.₂ инкубаторы, а в качестве дезинфицирующих средств использовались различные химические вещества. Некоторые примеры включают пары хлора, пары перекиси водорода, формальдегид и озон. Проблема с использованием химикатов в инкубаторе для клеточных культур заключается в том, что трудно быть уверенным, что все следы химикатов удалены, и могут потребоваться дополнительные меры предосторожности, которые трудно реализовать в лаборатории. Экспериментальные данные показывают, что даже очень небольшие количества летучих органических соединений хорошо растворяются в культуральной среде и приводят к цитотоксичности и экспрессии стрессовых белков. 11 Использование этих подходов следует рассматривать только тогда, когда они проводятся обученными профессиональными поставщиками услуг, поэтому они не рекомендуются для рутинного использования.

Вывод

При оценке вариантов контроля и устранения загрязнения вашего CO₂ инкубаторе, рассмотрите простоту использования и доказанную эффективность (с независимыми данными) в качестве своих основных задач. Лучшими методами являются те, которые требуют небольшого практического времени, чтобы быть эффективными. Сочетание стратегии непрерывного предотвращения заражения с периодическим методом обеззараживания и хорошей асептической техникой гарантирует, что ваши ценные клетки будут продолжать безопасно расти, способствуя вашим исследовательским или производственным целям.

использованная литература

1. Грайс, Э.А. и др., «Профиль разнообразия микробиоты кожи человека», Genome Research 18 (2008).
2. НАС.Агентство по охране окружающей среды, «Агентство по охране окружающей среды регистрирует медьсодержащие сплавы», Пестициды: актуальные и химические информационные бюллетени (май 2008 г.). http://www.epa.gov/pesticides/factsheets/copper-alloyproducts.htm.
3. Уилдон, Л.Дж. и др., «Антимикробная эффективность медных поверхностей против спор и вегетативных клеток Clostridium Difficile: теория прорастания», Журнал антимикробной химиотерапии 62 (2008).
4. Грасс Г., Ренсинг К. и Солиоз М., «Металлическая медь как антимикробная поверхность», Прикладная и экологическая микробиология (март 2011 г.).
5. Михельс, Х.Т. и др., «Медные сплавы для борьбы с инфекционными заболеваниями человека», Конференция по материаловедению и технологиям (2005 г.).
6. Ассоциация развития меди, «Снижение риска инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи: роль медных сенсорных поверхностей» (Хемел Хемпстед, Великобритания: публикация CDA 196, 2011 г.).
7. First, M.W., «Удаление переносимых по воздуху частиц из радиоактивных аэрозолей», в: «Обработка газообразных выбросов на ядерных объектах», Справочник по обращению с радиоактивными отходами, 2, ред. Гуссенс, В.Р.А., Эйххольц, Г.Г., и Теддер, Д.В. (Cooper Station, NY: Harwood Academic Publishers, 1991).
8. Чоузвуд, Л.К., и Уилсон, Д.Е., ред., «Первичная изоляция биологических опасностей: выбор, установка и использование боксов биологической безопасности» (Bethesda, MD: Национальные институты здравоохранения, Отдел охраны труда и техники безопасности, 2007 г.).
9. Бургенер Дж., «Документ с изложением позиции по использованию ультрафиолетового излучения в боксах биологической безопасности», Applied Biosafety 11, no. 4 (2006).
10. Мичан, П.Дж., и Уилсон, К., «Использование ультрафиолетового света в боксах биобезопасности: противоположный взгляд», Applied Biosafety 11, no. 4 (2006).
11. Бусудзима, Х., и Мистри, Д., «Сравнительный анализ обеззараживания ультрафиолетовым светом по сравнению с обеззараживанием». Высокотемпературная стерилизация в клеточной культуре CO₂ Инкубатор с использованием конструкции из нержавеющей стали, обогащенной медью, для достижения активного контроля фонового загрязнения» (Бенсенвилл, Иллинойс: Sanyo E and E America Company, 2007).
12. Кроут, Ф. и др., «Летучие органические соединения, цитотоксичность и экспрессия стрессовых белков HSP72, HSP90 и GRP78 в культивируемых клетках человека», Biochimica et Biophysica Acta, 1591 (2002).

Мэри Кэй Бейтс, мирового специалиста по клеточным культурам, Thermo Fisher Scientific, можно связаться по электронной почте marykay.bates@thermofisher.com или по телефону 218-525-2293.

Дуглас Вернершпах, глобальный менеджер по продукту, CO₂с инкубаторами Thermo Fisher Scientific можно связаться по электронной почте douglas.wernerspach@thermofisher.com или по телефону 908-575-9775.