Трехмерное соотношение ядра и цитоплазмы обеспечивает лучшее различение нормальных клеток и клеток аденокарциномы легкого, чем в двух измерениях.

Copyright © Авторы. Опубликовано SPIE под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Распространение или воспроизведение этой работы полностью или частично требует полной атрибуции оригинальной публикации, включая ее DOI.

Абстрактный.

Мы получили многофотонные изображения нормальных клеточных линий и линий аденокарциномы легкого в трех измерениях. Затем стопки изображений клеток обрабатывали для получения соотношения ядра к цитоплазме (N/C) в двух и трех измерениях. В то время как отношения N/C в трех измерениях могут быть однозначно определены из объемных соотношений ядра и цитоплазмы, двумерные (2-D) N/C могут варьироваться в зависимости от осевой плоскости, выбранной для определения отношения N/C. Мы определили двумерные отношения N/C по трем критериям: (1) аксиальное положение, при котором площадь ядра является наибольшей; (2) наибольшее значение отношения 2-D N/C; и (3) аксиальное положение в середине аксиального положения ядра. Мы обнаружили, что различные определения отношения 2-D N/C будут существенно влиять на его значение. Кроме того, в целом большая дисперсия была обнаружена в двумерных, а не в трехмерных (3-D) отношениях N/C. Отсутствие двусмысленности в определении и уменьшенная дисперсия позволяют предположить, что трехмерное соотношение N/C является лучшим параметром для характеристики опухолевых клеток в клинических условиях.

Ключевые слова: оптика, двухфотонная микроскопия, рак легкого, ядерно-цитоплазматическое отношение

1. Введение

Золотым стандартом клинической диагностики заболеваний, особенно при различении нормальных и раковых тканей, остается гистология. В наиболее распространенной реализации интересующая ткань фиксируется, заливается парафином, делается тонкий срез и метится гематоксилином и эозином для исследования под оптическим микроскопом. Затем патологоанатом определяет патологическое состояние образцов ткани путем качественного исследования и полуколичественной оценки.В случае рака положительная идентификация часто связана с более высоким отношением ядер к цитоплазме (N/C), характерным для опухолевых клеток. В частности, анализ отношения N/C был применен для характеристики мазков из полости рта, 1 ядерно-цитоплазматическое изменение указывает на диспластические изменения в тканях полости рта, 2 а высокие отношения CDK1 N/C коррелируют с плохим прогнозом у пациентов с колоректальным раком. 3 Кроме того, двухцветная двухфотонная визуализация обнаружила большее отношение N/C в образцах аденокарциномы толстой кишки. 4 В дополнение к тканевой гистологии в клинических условиях широко используются цитологические процедуры, такие как мазок Папаниколау, и анализ жидкостей организма, таких как мокрота, моча и перитонеальная жидкость. Несмотря на широкое использование соотношения N/C, среди наблюдателей были обнаружены значительные различия в ядерных соотношениях и межличностные различия в определении отношения N/C, что является постоянной проблемой при гистологическом анализе. 5 , 6

Неопределенность использования соотношения N/C для диагностики заболеваний связана с тем, что традиционно анализ отношения N/C является двумерным (2-D) по своей природе. Поскольку срезы ткани имеют размер порядка нескольких микрон, диагностика таких образцов представляет собой двумерное представление фактического образца. Моделирование показало, что в зависимости от физического местоположения и ориентации среза ткани геометрические факторы, такие как положение ядра, форма клетки и ориентация, могут значительно влиять на отношения 2-D N/C. 7 Таким образом, более точное определение соотношения N/C привело бы к уменьшению неопределенности в клинической дифференциации опухоли от нормальных клеток. Хотя такие методы, как автоматическое цифровое извлечение морфологических признаков, трехмерная (3-D) реконструкция серийных гистологических изображений и трехмерное отношение N/C, полученное с помощью оптической когерентной томографии, были разработаны для улучшения идентификации рака, 8 – 10 отсутствует сравнение эффективности двухмерного и трехмерного анализа соотношения N/C с помощью двухцветного флуоресцентного анализа.В этом исследовании мы визуализировали как нормальные клетки, так и клетки аденокарциномы легкого с помощью трехмерной многофотонной микроскопии. Пометив ядра и цитоплазму флуоресцентными красителями с различными спектральными свойствами, мы получили серийные изображения в трех измерениях для определения 2-D и 3-D отношений N/C.

2. Материалы и методы

2.1. Многофотонный микроскоп

Многофотонный микроскоп, использованный в этом исследовании, представляет собой самодельную перевернутую систему. В качестве источника возбуждения использовался выход 780-нм твердотельного лазера с диодной накачкой (Millennia, Spectra Physics, Санта-Клара, Калифорния) и титан-сапфирового лазера (Tsunami, Spectra Physics). После отражения от управляемой гальванометром системы зеркал x-y лазер направляется в инвертированный микроскоп (TE2000U, Nikon, Япония). Пара расширителей луча на входе микроскопа используется для увеличения лазерного пятна, чтобы обеспечить переполнение фокусирующего объектива. Затем расширенный пучок отражается в фокусирующий объектив первичным дихроичным зеркалом (720DCLR, Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont). В качестве объектива использовалась воздушная линза (Nikon S Fluor 20 × / NA 0,75) с рабочим расстоянием 1 мм и мощностью на образце 50 мВт. Сигнал, генерируемый в фокусном объеме, собирается фокусирующим объективом в эпи-освещенной геометрии и разделяется на общую четырехканальную систему обнаружения фотоумножителя. Использование дополнительных дихроичных зеркал (550DCXR, 495DCXR и 420DCLR) и полосовых фильтров (красный: 610/75 нм, зеленый: 525/50 нм, синий: 460/50 нм и генерация второй гармоники: 390/18 нм) позволяют разделить сигнал на три канала флуоресценции и один обратный канал генерации второй гармоники. В этом исследовании мы использовали только синий и красный каналы для обнаружения ядер, меченных Hoechst 33342, и цитоплазмы, меченной CellTracker™ Orange CMTMR, соответственно. Каждая плоскость оптического изображения имеет размер 253 × 253 мкм 2 .Для получения трехмерного изображения образцы помещают на трехосный столик для перемещения образцов (ProScan®, Prior Scientific, Великобритания). После получения оптического изображения в плоскости изображения образец перемещается в следующую осевую позицию для дальнейшего получения изображения. Таким образом, мы получили трехмерные изображения, разделенные 1 мкм. Стек трехмерных изображений обычно состоит из 20–30 изображений.

2.2. Подготовка нормальных и клеточных линий аденокарциномы легких

Чтобы сравнить 2-D и 3-D отношения N/C, мы использовали одну нормальную эпителиальную линию легкого (Beas2B) и две клеточные линии аденокарциномы легкого (CL1-0 и CL1-5). 11 Линии клеток культивировали в Roswell Park Memorial Institute 1640 (89%) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% Pen Strep (10 000 единиц/мл/пенициллин 10 000 мкг/мл) при 37°C и 5% CO 2 . По достижении 90% слияния клетки отделяли от культуральных флаконов с 0,05% трипсином и этилендиаминтетрауксусной кислотой и соскабливали. В этот момент клетки можно культивировать в камерах со стеклянным дном № 1,5 в течение 16–24 ч перед мечением. Чтобы пометить цитоплазму, сначала применяли 20 мкМ в фосфатно-солевом буфере (PBS) CellTracker™ Orange CMTMR (Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) в течение 30 минут. После трехкратной промывки PBS клетки метят Hoechst 33342 (Invitrogen) в концентрации 0,4 мкг/мл в течение 10 мин. Затем клетки снова трижды промывали буфером PBS перед установкой на многофотонный микроскоп для визуализации.

Для каждой клеточной линии были получены двухцветные многофотонные изображения высокого разрешения 20 клеток в трех измерениях. После получения изображения двумерные изображения в различных осевых положениях анализируются для анализа соотношения N/C. Для этого фоновый шум определялся по участкам изображения синего и красного каналов без клеток. Эти уровни фона использовались в качестве пороговых значений для соответствующих изображений синей и красной флуоресценции.Для определения площади цитоплазмы в качестве маски использовали изображение ядра. Затем изображения обрабатывали, определяя количество пикселей из изображений каждого канала флуоресценции. Таким образом определяются ядерная (N) и цитоплазматическая (C) области каждого двумерного изображения. Затем эти значения использовались для определения отношения 2-D N/C в каждой фокальной плоскости.

3. Результаты

На рисунке 1 (а) показаны репрезентативные многофотонные изображения клеток Beas2B, CL1-0 и CL1-5 в трех измерениях. Затем могут быть извлечены отдельные 2D-изображения с разной глубиной фокуса [рис. 1(b)]. Качественно ядро ​​самое большое для CL1-5, за ним следуют CL1-0 и Beas2B. Общий размер ячеек также следует той же тенденции. Кроме того, определялось двумерное отношение N/C на каждой глубине. Результаты показывают неопределенность в точном определении значения отношения 2-D N/C. В частности, изображения всех трех клеток на глубинах 10 и 15 мкм выглядят одинаково; однако отношения 2-D N/C могут отличаться от 0,36 до 0,26 (Beas2B), от 0,54 до 0,42 (CL1-0) и от 0,96 до 0,72 (CL1-5).

( а ) Репрезентативные многофотонные изображения клеток Beas2B, CL1-0 и CL1-5 в трех измерениях. (b) 2-D изображения трех клеток вместе с 2-D соотношением N/C на разных фокусных глубинах. Синий псевдоцвет: ядро, меченое Hoechst 33342; красный псевдоцвет: цитоплазма, меченная CellTracker™ Orange CMTMR.

Неопределенность, которая существует в точном определении отношения N/C в двух измерениях, дополнительно продемонстрирована на рис. 2, где мы нанесли площадь ядра, площадь цитоплазмы, двумерное отношение N/C и общую площадь клетки в зависимости от осевого положения. . В трех репрезентативных клетках аксиальное положение максимального размера ядра и соотношение 2-D NC не соответствуют и могут различаться в диапазоне от 4 до 8 мкм. Кроме того, в зависимости от осевого положения, выбранного для расчета отношения 2-D N/C, значения могут различаться в 2 раза.

Репрезентативные осевые профили площади ядра (N), площади цитоплазмы (C), общей площади клеток (N+C) и отношения 2-D N/C (500 ×) для клеточных линий Beas2B, CL1-0 и CL1-5.

Для количественной оценки различных значений отношения N/C в двух измерениях мы применили три определения двумерных отношений N/C: (1) N max : наибольшая площадь ядра. Отношение N/C рассчитывали в осевом положении, при котором площадь ядра является наибольшей; (2) N/C max: после определения отношения N/C на разных глубинах выбирается наибольшее значение отношения N/C; и (3) средняя точка N: была определена средняя точка аксиального положения ядра и рассчитано отношение N/C. Кроме того, ядерный и цитоплазматический объемы рассчитывали путем суммирования ядерных и цитоплазматических областей в каждой аксиальной позиции. Наконец, путем суммирования ядерных и цитоплазматических областей в каждой фокальной плоскости можно определить соотношение 3-D N/C. Помимо отображения среднего значения и стандартных отклонений этих параметров, мы также определили процент данных, отклоняющихся от средних значений (таблица 1).

Таблица 1

Статистический анализ физических характеристик клеточных линий Beas2B, CL1-0 и CL1-5 в двух и трех измерениях (было проанализировано по 20 клеток в каждой клеточной линии).

4. Дискуссия

В этом исследовании мы изучили 2-D отношения N/C, определенные по различным критериям, и 3-D объемное отношение N/C для нормальной клеточной линии эпителия легкого Beas2B и двух клеточных линий аденокарциномы легкого (CL1-0 и CL1-5). Мы обнаружили, что в зависимости от выбранного критерия отношения 2-D N/C могут сильно различаться (таблица 1). В частности, дисперсия данных, накопленных по 20 клеткам, значительно различается (от 21% до 86%), что позволяет предположить, что на соотношение 2-D N/C критически влияет геометрическая ориентация отдельной клетки в месте роста.С другой стороны, трехмерное объемное отношение N/C является однозначным в определении и показывает более низкую дисперсию (от 28% до 38%). В дополнение к более высоким отношениям 3-D N/C для раковых клеток мы обнаружили, что объемы ядер для CL1-0 (2768 мкм 3 ) и CL1-5 (3271 мкм 3 ) значительно больше, чем у Beas2B (1787 мкм 3 ). м 3 ), где объем цитоплазмы CL1-5 (5239 мкм 3 ) является самым большим, за ним следуют Beas2B (4756 мкм 3 ) и CL1-0 (3800 мкм 3 ). Следовательно, более метастатический CL1-5 11 является самым крупным типом клеток в ядре и цитоплазме, хотя он имеет меньшее отношение 3-D N/C, чем CL1-0. Поскольку трехмерное отношение N/C для Beas2B и CL1-5 статистически перекрывается, наши результаты предполагают, что в дополнение к анализу отношения N/C в трех измерениях следует включить другие показатели, такие как ядерный, цитоплазматический и общий размер клеток, для различения между нормальными и раковыми клетками в клинических условиях. Если пространственное разрешение определяется как размер фокального пятна, определяемый первыми минимумами диаграммы Эйри, то наше использование объектива с числовой апертурой 0,75 на длине волны 780 нм приведет к номинальным латеральным и аксиальным разрешениям 1,27 и 5,55 мкм соответственно. . Поскольку изображения были получены на разной глубине, использование объективов с разной числовой апертурой могло повлиять на результаты отношения N/C. В случае низкой числовой апертуры, несмотря на большую аксиальную глубину, соответствующее снижение латерального разрешения может внести неоднозначность в латеральное определение размера клеточных компонентов. Подход, описанный в этой работе, может быть применен к патологическому анализу в цитологии.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и технологий (МОСТ 107-2112-М-002-023-МУ3).

Раскрытие информации

Авторы не имеют соответствующих финансовых интересов в этом письме.

использованная литература

1. Коуп Дж. Г., Лонгмор Р. Б., Грин М. В., «Количественная эксфолиативная цитология нормальных чешуек полости рта: исследование, связанное с возрастом, местом и полом», JR Soc. Мед. 78 (12), 995–1004 (1985).10.1177/014107688507801204 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Хегде В., «Цитоморфометрический анализ чешуек предраковых и злокачественных поражений полости рта», J. Clin. Эксп. Вмятина. 3 (5), e441–e444 (2011). 10.4317/jced.3.e441 [CrossRef] [Академия Google]

3. Sung W.W. и др., «Высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение экспрессии Cdk1 предсказывает плохой прогноз у пациентов с колоректальным раком», BMC Cancer 14, 951 (2014). 10.1186/1471-2407-14-951 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Su Lim C., et al., «Измерение площади ядра и соотношения ядро/цитоплазма и митохондрия/ядро в тканях толстой кишки человека с помощью двухцветной двухфотонной микроскопии», Sci. 5, 18521 (2015). 10.1038/srep18521 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Шмидт Дж. Л. и др., «Визуальные оценки соотношения ядер к ядрам. Можем ли мы доверять нашим глазам, чтобы использовать критерии размера Bethesda ASCUS и LSIL? Рак 114, 287–293 (2008). 10.1002/cncr.23798 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

6. Vaickus L.J., Tambouret R.H., «Проблема молодого исследователя: точность оценки ядерно-цитоплазматического отношения среди обученных морфологов», Cancer Cytopathol. 123 (9), 524–530 (2015). 10.1002/cncy.21585 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

7. Никоненко А. Г. Модель секционирования клеток. Ядерно-цитоплазматическое соотношение изучено с помощью компьютерного моделирования», Анал. Квант. Цитол. гистол. 18 (1), 23–34 (1996). [PubMed] [Академия Google]

8. Онозато М.Л. и др., «Роль трехмерной (3D)-реконструкции в классификации аденокарциномы легкого», Анал. Клетка. Патол. (Амст.) 35 (2), 79–84 (2012). 10.3233/ACP-2011-0030 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. Тиран Дж. П., Мак Б., «Извлечение морфологических признаков для классификации цифровых изображений раковых тканей», IEEE Trans. Биомед. англ. 43 (10), 1011–1020 (1996). 10.1109/10.536902 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

10.Chang C.K., et al., "Сегментация ядра и цитоплазмы одной клетки в трехмерной томограмме с использованием оптической когерентной томографии", J. Biomed. Опц. 22 ( 3 ), 036003 (2017). 10.1117/1.JBO.22.3.036003 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Чу Ю. В. и др., "Выбор инвазивных и метастатических субпопуляций из клеточной линии аденокарциномы легких человека", Am. Дж. Дыхание. Ячейка Мол. биол. 17 (3), 353–360 (1997). 10.1165/ajrcmb.17.3.2837 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Статьи из Journal of Biomedical Optics предоставлены здесь с разрешения Общество инженеров фотооптического приборостроения