Каково значение ядерного буфера, разделяющего ДНК

Выделение высокомолекулярной ядерной ДНК

Вектор BAC может нести вставку длиной более 100 000 пар оснований. Однако стандартные методы выделения ДНК, как правило, разрезают ДНК на фрагменты, которые слишком малы, чтобы использовать пропускную способность BAC. Чтобы ограничить сдвиг ДНК, очищенные ядра помещают в агарозные пробки. Агароза обеспечивает физическую поддержку ДНК, предотвращая значительное срезание. Пробки инкубируют в буфере, содержащем протеиназу(ы) для расщепления белков и детергент для эмульгирования ядерных липидов, соответственно.

Подготовка ядер, подходящих для построения библиотеки ВАС, может быть одним из самых сложных шагов в создании библиотеки ВАС растений. Преобладающие проблемы, связанные с попытками выделения ядерной ДНК растений, обычно не возникают у исследователей животных.Например, (а) клеточные стенки растений должны быть физически разрушены или подвергнуты ферментативному перевариванию без повреждения ядер, (б) хлоропласты должны быть отделены от ядер и/или предпочтительно разрушены, что является важным процессом, поскольку копии хлоропластного генома могут составлять большую часть ДНК. внутри растительной клетки (c) необходимо предотвратить взаимодействие летучих вторичных соединений, таких как полифенолы, с ядерной ДНК, и (d) необходимо предотвратить захват ядер углеводными матрицами, которые часто образуются после гомогенизации тканей. Хотя было бы идеально, если бы существовал протокол выделения ядерной ДНК, который работал бы для всех видов растений, биохимическое и морфологическое разнообразие в царстве растений делает разработку такого протокола маловероятной (Loomis 1974, Peterson et al. 1997). Ниже мы представляем два совершенно разных протокола выделения ядерной ДНК, которые мы использовали для создания библиотек BAC из растений. ВАРИАНТ X — это многообещающий метод, который только недавно был использован в создании библиотеки BAC. ВАРИАНТ Y (или прототипы этого протокола) использовался при построении библиотек BAC в течение нескольких лет.

ВАРИАНТ X представляет собой адаптацию процедуры, первоначально разработанной для выделения миллиграммов высокочистой ядерной ДНК из помидоров (Peterson et al. 1997, 1998). Он имеет несколько особенностей, которые делают его подходящим для использования в создании библиотеки ВАС, а также в других приложениях молекулярной биологии: (а) Перед гомогенизацией ткани обрабатывают эфиром, чтобы сделать ядра более рыхлыми. Обработка эфиром заметно увеличивает выход ядер (Watson, Thompson, 1986; наши наблюдения). (b) Гомогенизация выполняется с помощью простого кухонного блендера. (c) Буфер для изоляции ядер (MEB) предназначен для решения нескольких общих проблем при экстракции ядерной ДНК растений. Во-первых, буфер содержит 2-метил-2,4-пентандиол (MPD) — соединение, помогающее стабилизировать ядра и предотвращающее их преждевременный лизис.Ядерный выход с использованием MEB в > 10 раз выше, чем при использовании буферов на основе сахарозы (Peterson et al. 1997 и наши наблюдения). Буфер также содержит антиоксиданты ß-меркаптоэтанол, диэтилдитиокарбамат натрия и метабисульфит натрия. Эти соединения ограничивают окисление полифенолов. В своих окисленных формах полифенолы ковалентно связываются с ДНК, делая ее коричневой и делая ее бесполезной (Katterman and Shattuck 1983; Guillemaut and Maréchal-Drouard 1992). Поливинилпирролидон в буфере адсорбирует полифенольные соединения, предотвращая их взаимодействие с ДНК (Loomis, 1974). (d) Низкий pH буфера (pH 6,0) служит для ингибирования окисления полифенолов. (д) После гомогенизации добавление Тритона Х-100 до концентрации 0,5% приводит к преимущественному лизису хлоропластов и митохондрий. Присутствие двухвалентных катионов (Mg 2+ ) в MEB предотвращает лизис ядер Triton X-100 (Watson and Thompson 1986). (e) Ядра отделяют от большей части дебриса центрифугированием в градиенте Перколла. Дальнейшие этапы низкоскоростного центрифугирования используются для удаления некоторых, если не большинства, зерен крахмала, которые обычно осаждаются с ядрами. (f) На протяжении всего протокола ядерные препараты исследуют с помощью светового микроскопа. Это позволяет исследователю визуально оценить концентрацию и чистоту ядер.

Мы использовали ВАРИАНТ X для выделения ядер и ядерной ДНК из многочисленных видов растений (например, сорго, сахарного тростника, винограда, хлопка, сосны, кактуса опунции, папоротника, арахиса, кипариса Лейланда). Полезность протокола для создания библиотеки ВАС была впервые продемонстрирована в августе 1999 г., когда его использовали для выделения ДНК, которая впоследствии использовалась для создания библиотеки 9X для Gossypium raimondii (Peterson et al., в процессе подготовки). За этим успехом вскоре последовало создание библиотеки 16X для винограда (Vitis vinifera) (Tomkins et al., в процессе подготовки) и библиотеки 9,2X для Gossypium hirsutum (Acala Maxxa) (Tomkins et al., в процессе подготовки).Используя ВАРИАНТ X, для арахиса (Arachis hypogaea 'Florunner') и томата (Solanum lycopersicum) были созданы агарозные пробки, содержащие ядерную ДНК подходящего размера и с возможностью ограничения для создания библиотеки ВАС. Пробки из арахиса в настоящее время используются в строительстве библиотеки BAC.

Еще одним потенциальным недостатком ВАРИАНТА X является то, что он предназначен для извлечения ядер из относительно больших количеств (около 500 г) свежей ткани. Еще предстоит проверить, можно ли масштабировать протокол для размещения меньшего количества ткани и/или использовать для выделения ДНК с высокой молекулярной массой из замороженной ткани.

ВАРИАНТ Y относительно прост и может использоваться для выделения ядерной ДНК из несколько меньшего количества свежих или замороженных тканей. Он использовался для создания библиотек ДНК многочисленных видов, включая рис, сорго, пшеницу, сахарный тростник, хлопок, сою, ячмень и арабидопсис. В ВАРИАНТЕ Y ткань растения растирают в жидком азоте, полученный гомогенат суспендируют в буфере на основе сахарозы (SEB = буфер для экстракции сахарозы), добавляют Тритон Х-100 для разрушения хлоропластов и митохондрий, гомогенат несколько раз фильтруют для удаляют большую часть клеточного мусора, а ядра осаждают центрифугированием. Относительно высокий рН СЭБ (рН 9,1) ингибирует активность эндогенных нуклеаз. Присутствие ß-меркаптоэтанола и ПВП в СЭБ противодействует некоторым негативным эффектам окисленных полифенолов. ВАРИАНТ Y использовали для получения ДНК размером в мегануклеотиды из однодольных и некоторых двудольных растений. Он особенно хорошо подходит для видов/тканей, которые содержат мало вторичных соединений или углеводов. Недостатки ВАРИАНТА Y включают относительно низкий выход ядер (и, следовательно, производство агарозных пробок с более низкими концентрациями ДНК), значительное загрязнение ядерных препаратов дебрисом и углеводами и ограниченный контроль полифенолов.

Для двудольных и непокрытосеменных мы рекомендуем исследователям начать с ВАРИАНТА X. В настоящее время мы предлагаем исследователям, работающим с однодольными растениями, сначала попробовать ВАРИАНТ Y. Если ни ВАРИАНТ X, ни ВАРИАНТ Y не работают для интересующего вида, можно попробовать ряд других протоколов ядерной изоляции (например, см. др., 1972; Коуч и Фриц, 1990).

I. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯДЕР

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ, ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ (подробности см. в ГЛАВЕ 2): MEB; МПБД; марля; суспензия 1X TE; 1X ТЕ (нестерильный); Перколл; диэтиловый эфир; 1% метиленовый синий; кухонный блендер; оптический микроскоп

1. Этот метод выделения ядерной ДНК можно использовать для выделения ДНК из взрослых растений и проростков.

1. У взрослых растений осторожно снимают молодые листья с интересующего растения. После удаления листа его немедленно погружают в раствор 1X TE. За одну изоляцию собирают примерно 200-500 г листьев.
2. Для выделения ДНК из рассады семена растений с высокой плотностью сажают в почву в тепличных лотках, засыпают семена 0,5 см почвы, поливают и помещают лотки в теплицу. Во время сбора урожая срежьте верхушки растений и погрузите верхушки в раствор 1X TE. Оптимальное время сбора урожая зависит от растения. Для однодольных дайте рассаде вырасти примерно до 20-30 см перед сбором урожая. Что касается двудольных растений, перед сбором урожая дождитесь появления и цветения настоящих листьев, так как семядоли являются стареющей тканью и не дают ДНК хорошего качества. За одну изоляцию собирают около 500 г сеянцев.

� Примечание 7.1: Выполняйте этот шаг в вытяжном шкафу!

Эфир удаляет воски и делает клетки более рыхлыми. Удаляют листья/проростки из эфира, а затем промывают их трижды (каждая промывка по 1 мин) в 4 л 4°C 1X TE (приготовлен из запаса 100X TE). Поместите листья/саженцы в 3 л ледяного MEB.Гомогенизируйте листья / саженцы в MEB с помощью кухонного блендера (максимальная скорость достигается в течение 30 секунд). Отжать гомогенат через шесть слоев марли, а затем профильтровать полученный фильтрат через 32 слоя марли. Если возможно, пусть эта вторая фильтрация происходит только под действием силы тяжести (т. е. без выдавливания).

� Примечание 7.2: Иногда некоторые или все ядра не осаждаются. Это может произойти, если партия перколла более вязкая, чем обычно, и/или клеточный дебрис образовал полутвердый барьер в пределах градиента, препятствующий прохождению ядер. Таким образом, важно не выбрасывать супернатант, если вы не уверены, что ядра находятся в осадке. Целесообразно посмотреть на каплю супернатанта под микроскопом (см. шаг 4), прежде чем отказаться от него. Если надосадочная жидкость состоит из нескольких отдельных слоев, проверьте по капле каждого слоя, прежде чем отбрасывать этот слой. Если в супернатанте обнаружены ядра (независимо от причины), самым простым решением является добавление 5-10 мл буфера MPD, встряхивание смеси и вращение пробирки со скоростью 650 g в течение дополнительных 30 минут. Если ядра все еще не осаждаются, разбавьте содержимое еще раз и снова прокрутите (хотя, по нашему опыту, в этом никогда не было необходимости).

� Примечание 7.3: Ядра высокой чистоты не образуют очень твердый осадок и могут выскользнуть из пробирки, если супернатант выбрасывается слишком сильно.

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ, ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ (подробности см. в ГЛАВЕ 2): жидкий азот; СЭБ; СЭБ+ВМЕ ; СЭБ+БМЭ/Тритон; Ступка и пестик; марля; чудоткань

1. Заморозить 15-100 г свежей растительной ткани в жидком азоте или взять 15-100 г замороженной ткани из морозильной камеры.
2. Поместите замороженную ткань в раствор, содержащий жидкий азот. Измельчите ткань в порошок с помощью ступки и пестика.
3. Перенесите порошок в охлажденный льдом SEB + BME в соответствующем контейнере (контейнерах). На каждый грамм ткани используйте примерно 10 мл SEB + BME (например, поместите 20 г замороженной ткани в 200 мл охлажденного льдом SEB + BME).
4. Поместите смесь на лед на 12 минут. В течение этого времени взбалтывайте содержимое контейнера каждые две минуты (время каждого взбалтывания = 20 секунд).

Примечание 7.4: С ядрами в буферах на основе сахарозы следует обращаться с особой осторожностью. Отсутствие двухвалентных катионов в сочетании с экстремальными осмотическими условиями в SEB + BME делает ядра чрезвычайно хрупкими. Если грубо взболтать, ядра сломаются.

II. ПОДГОТОВКА ЗАГЛУШЕК

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ, ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ (подробности см. в ГЛАВЕ 2): MPDB или SEB (в зависимости от того, использовался ли ВАРИАНТ X или ВАРИАНТ Y для выделения ядер); Лизисный буфер; агароза LMP; пробка формы

1. В колбе на 50 мл смешайте 0,15 г агарозы LMP с 10 мл MPDB (если для выделения ядер использовался ВАРИАНТ X) или 10 мл SEB (если для выделения ядер использовался ВАРИАНТ Y). Поставьте колбу на весы. Тарируйте остаток. Перенесите колбу в микроволновую печь и нагрейте смесь агарозы/буфера LMP, пока вся агароза LMP не перейдет в раствор (для этого может потребоваться некоторое кипячение). Поместите колбу обратно на весы. Добавьте воду MBG в колбу, пока шкала не покажет «0,00 г». Поместите алюминиевую фольгу поверх колбы и поместите колбу в водяную баню при 45°C.
2. Поместите форму (ы) штепсельной вилки агарозы на лед. Если формы-заглушки используются повторно, убедитесь, что они чистые (тщательно вымыты и промыты этанолом или промыты и стерилизованы УФ-излучением) и что на дно лунок наложена свежая лента.
3. Поместите пробирку с ядрами на водяную баню при 45°C на 10 минут.
4. Смешайте равный объем раствора агарозы LMP с предварительно нагретыми ядрами. Используя пластиковую пипетку с наконечником относительно большого диаметра, поместите смесь ядер/агарозы в лунки предварительно охлажденной формы-пробки (РИСУНОК 7.2). Поместите ведерко со льдом, содержащее форму для пробок и пробки, в холодильник. Дайте пробкам затвердеть в течение 30 минут.
5. Вытолкнуть пробки из форм для пробок в 50 мл лизирующего буфера. Формы пробок BioRad поставляются с небольшим пластиковым язычком, предназначенным для выталкивания пробок из форм (см. РИСУНОК 7.2).Тем не менее, чистого шпателя будет достаточно. Если выделение ядер было выполнено, как описано выше, свечи должны иметь цвет от белого до светло-желтого.
6. Инкубируйте пробы в лизирующем буфере при 50°C в течение 24 часов. Слейте лизирующий буфер из пробок и добавьте 50 мл свежего лизирующего буфера. Инкубируйте свечи при 50°C в течение дополнительных 24 часов.
7. Перенесите пробки в 50 мл свежего лизирующего буфера и храните при 4°C в течение ночи. � Примечание 7.5: Продолжительность времени, в течение которого пробы могут храниться в лизирующем буфере при 4°C без существенной деградации ДНК, по-видимому, варьируется от вида к виду. Для получения оптимальных результатов храните пробки в лизисном буфере не более нескольких дней. Если требуется более длительное время хранения, перенесите свечи (или другие кусочки агарозы, содержащие ДНК) в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл, содержащую 70% водный раствор этанола (20°C). Разрешить вилки для уравновешивания в 70% этаноле при комнатной температуре в течение не менее четырех часов. Поместите пробирку с заглушками при -20°C. Вилки могут храниться таким образом не менее 6 месяцев (если не значительно дольше) без заметной деградации ДНК. Перед проведением расщепления и т. д. пробы, которые хранились в 70% этаноле, переносят в 50 мл соответствующего водного буфера при 4°С. Первоначально пробки будут плавать поверх буфера. Однако, как только этанол выйдет из пробок, они опустятся на дно пробирки. В этот момент пробки готовы к дальнейшему использованию.